Cre-loxP 부위 특이적 재조합
Cre-loxP 부위 특이적 재조합은, 1981년에 bacteriophage P1의 연구로 찾아내진 부위 특이적 재조합 반응이다. [1] loxP라고 하는 특정의 DNA 배열을 표적으로 하고 있어, DNA 재조합 효소 Cre에 의해 촉매 된다. 1987년 듀퐁사(당시 )의 Brian Sauer가 진핵생물로의 응용법을 개발한 것을 단서에,[2] [3]현재는 조건적 유전자 녹아웃을 실시하는 목적등으로 넓게 사용되는 기술이 되고 있다.
목차
원리
bacteriophage P1가 대장균내에서 증식 할 때 , 살균 바이러스의 게놈을 환상화해 복제하기 위해서 이 재조합 시스템을 이용하고 있다.이 반응에 필요한 구성요소는 재조합 효소의 Cre와 표적 배열의 loxP 뿐이다.
재조합 효소 Cre
Cre 단백질은 부위 특이적 재조합 효소이며, DNA 분자의 특정의 배열(loxP)끼리의 사이에 재조합을 일으킨다.343잔기로부터 되어 분자량은 대략 38 kDa이다. [4] 치로신리콘비나제파미리에 속하고 있어 아미노 말단측의 일부분을 제외하면 Lambda 살균 바이러스의 인테그라제와 잘 닮은 구조를 하고 있다. [5] cre는 causes recombination의 뜻.[1]덧붙여 단백질명이 Cre이며, 유전자명은 cre이다.
반응 기구는 대략 다음 대로이다.우선 Cre의 단량체 2가 loxP 배열 양단의 13 bp의 배열을 각각 인식해, 그것이 2조 집합하는 것으로 반응의 장소가 형성된다.Cre의 324번째의 치로신이 loxP의 절단 부위를 공격해 쇠사슬 교환을 촉매 해, 홀리데이・교차점의 이성화를 거치고, 다시 같은 쇠사슬 교환을 한다.[5]
표적 배열 loxP
loxP는 원래 bacteriophage P1의 게놈중에 있는 34 염기로부터 되는 배열이며, 중앙 8 bp는 비대칭인 배열로 그 양측 13 bp가 대칭이 되어 있다. [6] lox는 locus of crossing over에, P는 살균 바이러스 P1에 유래하고 있다.[1]
| Cre 결합 부위 | 재조합 부위 | Cre 결합 부위 |
| ATAACTTCGTATA - | G^CATACAT | -TATACGAAGTTAT |
응용 기술
이 기술에 의해서, 연구자는 연구 대상의 생물의 유전자 발현을 제어하거나 특정의 DNA 배열을 제거하거나 염색체 구조를 개변하거나 하는 것이 용이하게 되었다. [7]
Cre는 일반적으로는 존재하지 않는 효소이기 위해, 유전자 재조합 기술에 의해 이용하고 싶은 세포로 Cre가 생산되도록(듯이) 할 필요가 있다.바꾸어 말하면, 발현되도록(듯이) 세공한 세포 이외로는 재조합이 일어나지 않는다.또 loxP 배열도 34 bp와 길기 때문에, 통상은 내재 하고 있지 않다고 생각할 수 있다.따라서, 특정의 장소에 loxP 배열을 준비하면, 그 자리소 이외로 재조합이 일어날 가능성은 지극히 낮다.
세포가 Cre를 생산하면, 그 세포의 게놈중에 있는 loxP 부위끼리의 사이에 재조합이 일어난다. 1개의 DNA 분자에 2개의 loxP 배열이 있는 경우, 그 방향에 의해서 결과가 바뀐다. loxP끼리의 방향이 역이면 낀 배열은 반전하지만, 같은 방향이라고 낀 배열이 잘라진다. 이것에 의해서 예를 들면 염색체의 일부를 전치・결여되어 없어짐 시키거나 염색체끼리를 전위 시키거나 할 수 있다.
조건적 녹아웃
개체의 발생에 필수적인 유전자는 단순한 방법으로는 녹아웃 개체를 얻을 수 없지만, Cre-loxP계를 이용하는 것으로 특정의 조건하에서만 유전자 녹아웃 하는 것이 가능하게 된다.
발현 특성이 기존의 프로모터를 이용하고, Cre를 특정의 조직 혹은 특정의 시기에 생산하는 마우스를 준비한다. 예를 들면 만약 뇌로 만여라 OFF로 하고 싶으면, 거기서만 기능하는 프로모터를 찾아, 그 뒤로 Cre의 유전자 cre를 연결하고, 뇌로 만여라 Cre가 생산되도록(듯이) 한다. 다음에, 목적 유전자의 전후에 loxP를 삽입한 마우스를 준비한다. 이 2개의 마우스를 교배시켜 얻을 수 있던 자손 가운데, 쌍방의 유전자를 가지는 것을 선택한다.
사용하고 싶은 프로모터가 배발생의 초기에도 활성화 해 버리는 것은 자주 있다. 그런 경우를 위해서, cre의 프로모터를 개변해 드키시사이크리나 타모키시펜등의 약제를 사용해 활성화를 유도 할 수 있도록 하는 것으로, 확실히 녹아웃을 제어할 수 있는 계가 있다.
조건적 유전자 수복
loxP의 방향을 조정하는 것으로, 유전자를 배제해 버리는 것이 아니라, 역위 시키고 기능을 멈추어 두어 필요에 따라서 다시 역위 시켜 기능을 회복시킬 수도 있다.
선택 마커의 제거
유전자 개변을 할 때에, 약제 내성등의 선택 마커를 이용하는 일이 자주 있다. 그러나 이러한 선택 마커의 존재가 실험 결과를 왜곡할 가능성이 존재한다. 거기서, 마커 유전자의 전후에 loxP를 배치해 유전자 개변을 실시해, 목적의 개변 개체를 얻은 나중에 cre의 발현을 유도하면, 선택 마커를 제거할 수 있다.
참고 문헌
- ^ a b c Sternberg, N. and Hamilton, D. (1981). "Bacteriophage P1 site-specific recombination. I. Recombination between loxP sites". J. Mol. Biol. 150 (4): 467-486. doi:10.1016/0022-2836(81)90375-2. PMID 6276557.
- ^ Sauer, B. (1987). "Functional expression of the Cre-Lox site-specific recombination system in the yeast Saccharomyces cerevisiae". Mol. Cell. Biol. 7 (6): 2087-2096. PMID 3037344.
- ^아메리카 합중국 특허 제 4,959,317호
- ^ Sternberg, N., Sauer, B., Hoess, R. and Abremski, K. (1986). "Bacteriophage P1 cre gene and its regulatory region. Evidence for multiple promoters and for regulation by DNA methylation". J. Mol. Biol. 187 (2): 197-212. doi:10.1016/0022-2836(86)90228-7. PMID 3486297.
- ^ a b Ghosh, K. and Van Duyne, G.D. (2002). "Cre-loxP biochemistry". Methods 28 (3): 374-383. doi:10.1016/S1046-2023(02) 00244-X. PMID 12431441.
- ^ Hoess, R.H., Ziese, M. and Sternberg, N. (1982). "P1 site-specific recombination: nucleotide sequence of the recombining sites.". PNAS 79 (11): 3398-3402. PMID 6954485.
- ^ Nagy, A. (2000). "Cre recombinase: The universal reagent for genome tailoring". Genesis 26 (2): 99-109. PMID 10686599.
외부 링크
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